摘  要：本试验研究猪冷冻精液在规模化猪场的应用。通过引进加拿大猪冷冻精液150剂，在广西农垦良圻原种猪场二个规模化种猪场进行配种。试验表明：猪冷冻精液输精受胎率、分娩率约是常规鲜精组的57%、75%（p<0.01），产总仔、健仔约是常规鲜精组的75%、80%（p<0.01）。在规模化猪场推广猪冷冻精液配种技术，需要严格的猪冷冻精液的保存条件、运输条件、配种时间以及猪场的环境控制工艺、生物安全体系模式。
关键词：人工授精；猪冷冻精液；深部输精
 
    人工授精技术起源于1780年意大利科学家Spallanzani，其通过对比格犬进行人工授精并取得成功^［1］。而应用于猪的人工授精技术的探索则始于20世纪30年代。1956年，Ploge在他的《猪人工授精》一书中，描述了源于20世纪30年代前苏联国营农场所探索、应用的包括采精、精液稀释和输精等相关的猪人工授精技术，论述猪人工授精可以使得高质量公猪得以更广泛的应用，低风险、低成本的引入新的遗传物质，实用且不引入疾病等优点^［2］。但由于受限于当时的保存、稀释、配送网络、输精工具等条件，直到上世纪60-80年代，猪人工授精技术才得以大范围的推广，并在欧洲、亚洲等地迅速普及。我国猪人工授精技术于20世纪90年代开始被广大养殖企业和养殖户所接受和应用推广。目前国内养猪行业采用人工授精技术对母猪进行授精的比例，在集约化的大中型种猪场中这一比例超过95%。猪人工授精技术的普及，加快了优秀公猪的遗传物质推广，提高生产效率，取得了很高的经济效益。但是优秀公猪精液的长期保存、运输、遗传物质的国际间交流等问题依然是一道道难题，阻碍养殖行业的快速发展。
随着科研人员的深入研究，人工授精技术又取得新的进展，即猪冷冻精液技术：利用干冰（-79℃）、液氮（-196℃）、液氦（-269℃）等作冷却源，将精液特殊处理后冷冻，保存在超低温的液氮（196℃）状态下，达到长期保存的目的，并且解冻后能够使精子达到输精的要求。世界许多科学家在精液冷冻液配方的筛选、提高解冻后精子的活率和顶体完整率等方面进行了较多研究。猪冷冻精液的得以在生产实践中推广开来。1976年，广东农科院畜牧繁殖所经过4年的努力，完成了猪冷冻精液的制作、稀释、配种、分娩等一系列试验，对国内猪冷冻精液的研究打下了坚实的基础^［3］。
    猪冷冻精液技术具有长期保存精液，不受时间、地域的限制开展省际、国际之间的优秀种猪的遗传物质交流，进行后裔测定后选择优良种猪，降低血缘更新、引种等生产成本等方面的巨大优势。但是也存在解冻后精液质量不佳，繁殖成绩不稳定，生产成本高，应用设备要求高，受输精环境影响大等一系列的问题。并且国际上较多的冷冻精液供应企业对猪精液的稀释、冷冻、解冻等条件都不一致，导致行业内缺乏通用的冷冻精液使用规程，猪冷冻精液应用效果评估也较少。为了更好的开展育种工作，提高遗传进展，广西农垦永新畜牧良圻原种猪场开展了一系列加裕公司猪冷冻精液的应用研究，为规模化猪场的猪冷冻精液应用提供参考依据。
一、试验设计
1  材料与方法
    1.1  试验材料及设备
    猪冷冻精液：由加拿大加裕公司进口；
    试验动物：广西农垦永新畜牧集团有限公司良圻原种猪场3-5胎龄新美系大白、长白、杜洛克种母猪；
    设备及耗材：液氮储存罐、长臂手套、冻精稀释粉、去离子水、80ml深部输精瓶、烧杯若干、恒温水浴锅、3L容量保温杯、计时器、长钳子或大镊子、纸巾、剪刀、红外线温度探测仪、磁力搅拌器、移液器等。
    1.2  试验地点和时间
    试验地点：广西农垦永新畜牧集团有限公司良圻原种猪场第二种猪场（传统场）、第四种猪场（全程空气过滤场）；
    试验时间：2016年6月9日—2016年12月18日；
                        2016年9月10日—2017年1月22日。
2  试验设计及操作规范
    在第二原种猪场选择约50头健康的正常发情的3-5胎龄经产母猪（新美系大白、长白）进行纯繁，在第四原种猪场选择约100头健康的正常发情的3-5胎龄经产母猪（新美系大白、长白、杜洛克）进行纯繁，按照生产批次陆续开展猪冷冻精液的人工授精，基础日粮与其余母猪相同。每头母猪配种2次，妊娠30天时B超检查受胎情况，母猪分娩时记录总仔、健仔、畸形、死胎、木乃伊等。试验观察猪群健康状况、采食情况、粪便情况等，保持圈舍通风、卫生、干燥，日常饲养管理和免疫消毒程序、疾病的治疗与防治按猪场常规方法进行。发现返情、空胎猪只时记录时间，并在试验记录中做好标识。
    同期使用鲜精进行常规人工授精并纯繁的母猪，即为对照组；
3  猪冷冻精液的解冻及稀释
    3.1  从液氮中取出1-2支冷冻精液麦管（0.5ml/支），立即转入38℃水浴锅中解冻；
    3.2  将麦管在38℃下解冻20秒，立即取出冷冻精液，解冻时间不能过长，否则易导致精子死亡；
    3.3  用干净面巾纸擦干冷冻精液管外部；
    3.4  晃动精液管将气泡移至将要开口的一端（上端）；
    3.5  竖直麦管，用剪刀剪开上端，避免精液与剪刀的接触；
    3.6  倒转麦管于事先预热至26℃的精液管，剪开精液管另一端棉塞，将精液从吸管倒入精液瓶中。8支冷冻精液为一个输精头份，最终获得精液精子数量为40亿精子；
    3.7  缓慢加入预热至26℃解冻稀释剂60ml；
    3.8  封好输精瓶备用，运输至配种舍时不能剧烈摇晃；
    3.9  解冻稀释液配制：把50gAndrohep®CryoGaurd™-Thaw粉剂溶解于1L预温至26℃的去离子水中，让酸碱度（PH）稳定后（1小时）再作为稀释剂。不能将剩余的稀释剂冰冻后再使用。如果使用不足1000ml时，可按照配制比例1g溶解于20ml去离子水中进行配制。
4  冻精品质的检测
    将冻精解冻后孵育10分钟后取10ul样品于预热至37℃的载玻片上，加盖玻片用精子分析仪观测精子活力和快速直线运动精子比例，选择活力≥20％的精液进行输精试验。
5  使用解冻的精液进行授精及注意事项
    5.1  由于解冻后精子的活力比鲜精有较大程度的下降，精液应在解冻后20分钟内使用；
    5.2  配种的母猪应选择，断奶后4-6天正常发情的3-5胎经产母猪，在发情后24、36小时各输精一次，异常发情、返情的母猪不宜用冷冻精液配种；
    5.3  后备母猪最佳效果在第三次发情期，发情后12、24小时各输精一次；
    5.4  使用冷冻精液配种时必须使用子宫颈深部输精。
6  统计指标
    使用KFnets软件记录每头母猪的与配公猪、配种时间、B超妊检结果，分娩时间、分娩结果等；
7  数据处理及统计分析
    数据采用SPSS22.0软件进行统计分析，与对照组母猪繁殖情况进行比较。结果以平均数±标准差表示，其中p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异极显著。
二、试验结果与分析
    1  第二种猪场试验结果
    由表1可知，第二种猪场在6月9日至7月15日，场内总计配种511头，其中猪冷冻精液人工授精51头，纯繁配种头数96头，配二元杂364头。冻精的精子在37℃下复苏3-5分钟后镜检活力在0.44±0.22，常规输精的精子活力0.82±0.11。纯繁的繁殖成绩为受胎率92.71%，分娩率86.46%，冷冻精液配种母猪的繁殖成绩为受胎率52.94%，分娩率49.02%。卡方检验表明，冷冻精液配种母猪的受胎率、分娩率等均与同期的纯繁相比差异极显著，冷冻精液配种只有常规人工授精成绩的57%左右。
 
 

项目	活力	配种（窝）	受胎（窝）	分娩（窝）	受胎率（%）	分娩率（%）
冻精	0.44±0.22	51	26	24	52.94%	49.02%
本场纯繁	0.82±0.11	95	89	83	92.71%	86.46%
成绩对比					57.11%	56.70%
卡方（x2）					34.054	23.95
P					<0.0001	<0.0001

    由表2可知，第二种猪场猪冷冻精液总仔9.12头，活仔7.48头，本场同期纯繁总仔11.86头，活仔10.05头。冷冻精液配种母猪的总仔、活仔等均与同期的纯繁相比差异极显著，冷冻精液配种只有常规人工授精成绩的74%~76%左右。活仔率两者差异不显著，但是冻精组仍比常规组少2.7个百分点。

项目	配种窝数（窝）	受胎窝数（窝）	分娩窝数（窝）	总仔（头）	健仔（头）	活仔率（%）
冻精	51	26	24	9.12	7.48	82.02%
本场纯繁	95	89	80	11.86	10.05	84.74%
成绩对比				76.90%	74.43%	96.79%
P				<0.001	<0.001	>0.05

    由表3可知，猪冷冻精液出生窝重、断奶窝重、断奶均头重、哺乳仔猪成活率等成绩分别为11.79kg、50.17kg、7.6kg、92.74%，本场同期纯繁成绩为13.71kg、60.79kg、6.85kg、90.55%。冷冻精液配种母猪的出生窝重、断奶窝重等比同期的纯繁成绩低14%-18%，但是冷冻精液组哺乳仔猪断奶均头重比同期的纯繁成绩高0.75kg/头，成活率比同期的纯繁成绩高2.2%，可能是冷冻精液组带仔少于对照组所引起。母猪比例冻精组比常规组高24%。

项目	配种（窝）	受胎（窝）	分娩（窝）	出生 窝重（kg）	断奶 窝重（kg）	断奶 均头重（kg）	哺乳仔猪成活率（%）	公母比例（%）
冻精	51	26	24	11.79	50.17	7.6	92.74%	1：1.3
本场纯繁	95	89	83	13.71	60.79	6.85	90.55%	1：101
成绩对比				86.04%	82.53%	110.98%	102.42%	124.06%

2  第四种猪场试验结果
    由表4可知，第四种猪场在2016年9月10日2017年1月22日，场内总计配种1301头，其中猪冷冻精液人工授精99头，全部种猪都是纯繁配种。冻精的精子在37℃下复苏3-5分钟后镜检活力在0.58±0.18，常规输精的精子活力0.77±0.17。常规配种的繁殖成绩为受胎率89.95%，分娩率85.44%，冷冻精液配种母猪的繁殖成绩为受胎率76.05%，分娩率69.70%。卡方检验表明，冷冻精液配种母猪的受胎率、分娩率等均与同期的纯繁相比差异极显著，冷冻精液配种只有常规人工授精成绩的82%-84%左右。第四种猪场猪冷冻精液总仔9.74头，活仔7.81头，本场同期纯繁总仔12.09头，活仔9.72头（含杜洛克）。冷冻精液配种母猪的总仔、健仔、出生窝重等均与同期的纯繁相比差异极显著，冷冻精液配种只有常规人工授精成绩的80%~82%左右，差异极显著；活仔率均在80%左右，差异不显著。

项目	品种	配种	受胎	分娩	总仔	健仔	公	母	出生窝重	受胎率	分娩率
冻精	DD	24	20	18	7.33	5.83	2.83	3.11	9.84	83.33%	75.00%
	LL	33	25	25	10.80	8.16	4.72	4.60	14.71	75.76%	75.76%
	YY	42	29	26	10.38	8.85	4.77	4.77	15.41	69.05%	61.90%
	合计	99	74	69	9.74	7.81	4.25	4.28	13.70	76.05%	69.70%
常规	DD	190	165	174	10.48	8.39	4.92	3.10	13.23	91.58%	86.84%
	LL	386	333	344	12.29	10.16	5.98	4.28	16.69	89.12%	86.27%
	YY	626	529	558	12.46	9.86	5.86	3.87	15.52	89.14%	84.50%
	合计	1202	1027	1076	12.09	9.72	5.75	3.88	15.53	89.95%	85.44%
P					<0.01	<0.01			<0.01	<0.01	<0.01

三、讨论
    猪的冷冻精液技术是人工授精的一项重大的变革，对开展联合育种、加快遗传进展、提高优秀种猪的利用率有着重大意义。但是这一新技术的应用还存在不少丞待解救的难题：一是猪精液的冷冻工艺还需要改进。国内外较多报道显示，冷冻精液的稀释液与冷冻保护剂的配制、降温速度、精液的包装方法等有着不同的方式与方法，解冻后精液的质量也参差不全。二是猪冷冻精液的解冻方法没有进行有效的统一。权凯^［4］等直接将5mL/袋的猪袋装冷冻精液从液氮中取出，用剪刀剪开两端后投入到40℃盛有BTS常温保存液的50mL猪一次性输精瓶中，在40℃水浴下摇动至完全溶解，解冻后，活率均在0.4以上、死活精子比例为59％~74％、顶体完整率58.7％~71.6％、有效存活时间为50~80min；张渭斌^［5］等从液氮罐中取出2~3支0.5mL/支的细管迅速投入38℃水浴锅中解冻30s，用干净的纸擦干细管，剪开细管将精液倒入预热至26℃的集精瓶中，然后缓慢加入预热至26℃的解冻液，边加边摇，先按1：1体积比进行低倍稀释，40s后再加至所需量，活力最高的达到（42.4±0.9）%，质膜完整率为（47.2±0.3）%，顶体完整率为（46.8±0.4）%。三是输精试验的母猪数量少，且结论不一致。权凯等采用三个品种（长白、大约克夏、杜洛克）合计121头正常发情的母猪进行冷冻精液输精试验，情期妊娠率为90.2％、窝产仔数10.6个、活仔率95.7％，与液态保存猪精液的人工授精结果无显著性差异（P>0.05）；夏天^［6］等经液氮储存的猪精液在52℃水温下解冻12s，解冻活力在O．3级以上，输精6头母猪，产仔55头，平均9.16头，活仔53头，平均8.82头，低于常规鲜精配种；张渭斌等研究结果表明冷冻精液平均妊娠率为72％，产仔数为6.64±0.82，显著低于常规鲜精水平。
本试验在第二种猪场开展时，冷冻精液组受胎率、分娩率分别是常规鲜精组的57.11%、56.70%，总产仔9.12头，健仔7.48头，是常规鲜精组的76.90%、74.43%。第四种猪场开展时，冷冻精液配种母猪的繁殖成绩为受胎率76.05%，分娩率69.70%，常规配种的繁殖成绩为受胎率89.95%，分娩率85.44%，试验组是常规鲜精组的84.55%、81.58%；冷冻精液总仔9.74头，活仔7.81头，本场同期纯繁总仔12.09头，活仔9.72头（含杜洛克），试验组是常规鲜精组的80.58%、80.37%。
    两组试验结果差异的原因可能有以下几个方面：
    1、冷冻精液的解冻稀释过程有差异。第二种猪场精液解冻稀释实验室距离储存冷冻精液的液氮罐距离约1km，采用保温杯将冷冻猪精麦管运至实验室的途中会受到高温天气的影响，导致精液质量下降，精子死亡；第四种猪场精液解冻稀释直接在全环境控制、空气过滤的公猪站中进行，减免掉运输猪精的外部环境干扰因素。
    2、配种时间不同。第二种猪场精液解冻后配种时间在早上8：30、下午6：00以后；第四种猪场精液解冻后配种时间在早上7：30、下午5：30以后。配种时间的提前，环境温度适宜，能够减少由于广西夏季气温高对母猪产生的应激。
    3、环境控制不同。第二种猪场未采用全环境控制，较第四种猪场先进的空气过滤系统有一定的差距，母猪配种后适宜的环境有利于受精卵的着床。
四、结论
    猪冷冻精液在规模化猪场的应用表明，冷冻精液配种母猪的繁殖成绩显著低于常规鲜精配种母猪。受胎率、分娩率是常规鲜精组的57%、75%左右，产总仔、健仔是常规鲜精组的75%、80%左右。猪冷冻精液的保存、运输、配种时间以及猪场的环境控制工艺、生物安全体系模式，影响着猪冷冻精液的繁殖成绩。如何缩小猪冷冻精液与常规鲜精输精的成绩，在规模化猪场推广猪冷冻精液配种技术，还需要进一步的研究。
 
参考文献
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［2］ Polge C. Artificial insemination in pigs ［J］. Vet Pee， 1956， 68：62- 76.
［3］ 广东农科院畜牧所繁殖室，猪冷冻精液的研究［J］. 畜牧兽医科技， 1998， 2：1-5.
［4］ 权凯，张长兴，尹慧茹，等. 猪袋装冷冻精液的制作和人工授精效果探讨［J］. 中国畜牧杂志，2009，（23）.
［5］ 张渭斌，刘丑生，孙世铎，等. 咖啡因对猪精液冷冻的影响及冷冻-解冻方法的优化［J］. 中国畜牧兽医，2010，（10）：148-152.
［6］ 夏天 高金銮，等. 猪冷冻精液技术应用研究［J］. 黑龙江动物繁殖，2013，（1）：43-47.