这四个措施可以有效提高猪精液保存质量和使用效果
1.精液冷冻保存原理
精液冷冻保存通常以液氮(-196℃)作为冷源,对精液进行特殊处理,通过超低温抑制精子代谢活动,使精子处于休眠状态;通过冷冻保护剂及其他技术措施(如降温速度)来降低冷冻损伤,从而实现长期保存。当温度回升后又能复苏,且具备受精能力。
冷冻保护剂是当前精液冷冻保存的必备物质,能减少精子冷冻-解冻过程产生的物理和化学损伤,分为渗透性和非渗透性冷冻保护剂。渗透性冷冻保护剂(甘油、二甲亚砜等)可与水分子结合并透过细胞膜,改变膜脂和蛋白质排布,增加膜流动性和低温脱水程度,稀释溶质浓度,减少细胞内冰晶形成。非渗透性冷冻保护剂(蛋黄、脱脂牛奶、海藻糖、蔗糖等)不能透过质膜,通过改变渗透压引起细胞脱水,在细胞外发挥非特异性保护作用。但冷冻保护剂使用浓度不当会对精子造成渗透胁迫和毒性效应。
2.精液冷冻保存方法
精液冷冻技术大致可分为常规冷冻(conventional freezing)、定向冷冻(directional freezing)和玻璃化冷冻(vitrification)。
(1)常规冷冻保存技术 又称等轴冷冻(equiaxed freezing),包括手工冷冻技术和程序冷冻技术,其中手工冷冻目前应用最为广泛。通常将装有精液的0.25或0.5 mL塑料细管置于液氮上方4-5 cm处,熏蒸时长10分钟左右,然后放入液氮中储存,冷冻速率约为60℃/min。程序冷冻是利用程序降温仪控制不同温度范围内的降温或冷冻速率,其降温程序具有物种特异性。有研究表明程序冷冻法解冻后精子活力优于液氮熏蒸法。但常规冷冻方法存在冰晶形成难以控制、潜热耗散差造成反复冻融的缺点,由此导致了一种新的冷冻技术的出现,即定向冷冻技术。
(2)定向冷冻技术 使用了多温度梯度装置,精液稀释后以0.3℃/min的速度冷却到4–5℃,分装于预冷的空管中(5、8或12 mL);然后管子以恒定速度(1.0–1.5 mm/s)通过5℃(温块)到-50℃(冷块)的线性温度梯度模块;接着将管子移至-100℃的收集室,并转移到液氮中储存。Saragusty等(2016)提出,当通过定向冷冻技术冷冻大量精液时,无需控制冰核形成。该方法具有冷却均匀、潜热耗散高效、允许冷冻大量精液、减少精子机械损伤的优点,在多种家畜和野生动物的精液冷冻效果优于常规细管冷冻法。
(3)玻璃化冷冻技术 是一种新兴的冷冻保存技术,它利用高浓度的冷冻保护剂处理精液,精液分装于细管后可直接投入液氮,与传统冷冻保存技术相比具有平衡时间短、冷冻速度快、无需昂贵设备、不产生冰晶损伤的优点。但高浓度的冷冻保护剂会对精子产生致命的渗透效应和毒性损伤,限制了其应用。研究表明,不使用渗透性冷冻保护剂对人类精子进行玻璃化冷冻是可行的,而猪、牛精子不宜进行玻璃化冷冻。
3.冷冻耐受精液的选择
关于不同公猪精液冷冻敏感性的机制目前仍不清楚,可能与其遗传因素或精液成分有关。猪精子对温度的敏感性自精液采集后就会表现出来,因此有人提出精液冷冻不应在精液采集后6 h内进行,而应在液态保存18-24 h后再挑选质量好的进行冷冻保存。
4.冷冻稀释液的优化
精液冷冻稀释液应有足够的pH缓冲能力、适宜的渗透压和抗冷冻损伤作用。常用的冷冻稀释基础液为Tris卵黄稀释液、Modena稀释液、beltsville稀释液等。添加促进细胞膜流动性的物质(如卵黄等)可降低精子冷休克的发生,添加胆固醇有助于改善解冻后精子“冷冻获能”状态。同时,应尽量选择毒性低的冷冻保护剂,并优化使用剂量。据报道,甘油的使用浓度通常为4-6%,但随着稀释液中卵黄浓度的增加,甘油浓度可降低至2-3%。
5.精液处理和冷冻-解冻程序优化
采集精液进行1-2倍稀释后再进行品质评定,选择精子密度大于2亿/mL、精子活力大于80%、畸形率小于15%的精液进行冷冻。精液稀释倍数会影响精子冷冻存活率,稀释倍数不宜过高。剂型宜采用0.25或0.5 mL塑料细管,通过液氮熏蒸或程序冷冻仪进行冷冻,并根据实际情况优化冷冻-解冻条件。
6.抗氧化与损伤修复
为了对抗精液冷冻-解冻过程的氧化应激,可通过添加抗氧化剂来中和氧自由基(ROS)的不良影响;或通过降低精液氧分压、去除精液中白细胞和异常精子等来减少ROS的产生。近期研究表明,精清、脂质体、胞外囊泡和一些纳米材料有助于改善猪精子冷冻损伤与损伤修复。通过冷冻前去除精清、解冻时添加10%精清的方法(图2),可以显著提高猪冷冻精液配种受胎率。
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