摘  要：为了探究酪氨酸蛋白激酶（G酶）抑制剂对猪精子冻后质量及获能状态的影响，分别在精液冷冻稀释液中添加不同浓度（0、25、50、75、100 mg/L）的G酶抑制剂，按照不同时间（30、60、90 min）孵育后，分装、降温、5 ℃平衡并按照精液冷冻程序冷冻后投入液氮保存。解冻后检测精子活力、顶体完整率、质膜完整性等表观指标，同时采用分光光度计检测各组Ca²⁺浓度变化。结果表明，各试验组所检测指标均极显著差于新鲜精液组（P<0.01）；与对照组相比，试验组30 min（50 mg/L）组和90 min（50、75、100 mg/L）组精子活力差异显著（P<0.05），60 min（50、100 mg/L）组差异极显著（P<0.01）；90 min（50、75、100 mg/L）试验组顶体完整率差异显著（P<0.05），60min（50 mg/L）试验组差异极显著（P<0.01）；90 min（50 mg/L）组质膜完整性差异显著（P<0.05）；试验组在60 min（100 mg/L）和90 min（75 mg/L）条件下，Ca²⁺浓度降低差异显著（P<0.05），其中60 min（100 mg/L）组显著好于90 min（75mg/L）组（P<0.05）。总之，G酶抑制剂可以抑制精子冷冻过程中的被动获能，提高猪精液的冻后质量，但其作用的适宜浓度和条件尚需进一步研究。
关键词：酪氨酸蛋白激酶抑制剂；猪；精液冷冻；获能
 
人工授精技术使优良种公猪的精液得到广泛使用，可以保持猪的优良品种，并且具有生产成本低、操作简单、保障生物安全等优点。调查显示，在西欧国家猪人工授精被广泛采用，普及率达 90%以上，母猪分娩率与仔猪存活率都处于高水平状态^［1］。而精液冷冻技术将成为人工授精的******，亟需推进猪精液冷冻技术的进展。
全球对于精液冷冻的研究从未停止，但对精子获能通路的研究目前尚不明确^［2］ 。研究表明，无论采用何种冷冻保护剂、何种冷冻方法都损害了精子的受精能力，并伴随蛋白质的丢失、表达量的改变、功能活性的增减等，这就迫使该领域的研究向充分揭示冷冻对精子损伤的机理方向转移，希望通过揭示冷冻保存所导致的蛋白质结构和功能改变的实质，充分阐明冷冻损伤的机理，为猪精液冷冻保存提供理论依据，并最终促进猪精液冷冻保存技术的快速发展^［3］。
研究表明，精子的获能与胆固醇含量、Ca²⁺浓度、HCO3ˉ浓度、pH 值、蛋白质酪氨酸磷酸化、活性氧（ROS）等因素密切相关。精子获能是一系列的生理生化反应过程，步骤分为超激活运动即精子鞭毛运动的频率及类型发生改变；精子膜结构及特征的精细改变；顶体反应（标志着精子获能已经完成） ^［4-10］ 。蛋白质通过磷酸化或去磷酸化调节精子获能和顶体反应等一些重要的现象，这是精子到达、结合、穿透和融合卵母细胞所必需的过程。因此蛋白磷酸化是获能的一个非常重要的过程，尤其是在酪氨酸残基处的磷酸化是获能过程中发生的最重要的事件之一，且酪氨酸磷酸化可能是细胞中信号转导途径的主要甚至是唯一的指标^［11］。
Ca²⁺在精子获能过程中起着关键的调控作用。精子内Ca²⁺浓度的增加激活可溶性腺苷酸环化酶（sAC）和磷酸二酯酶（PDE），使环磷酸腺苷（cAMP）含量增加，并通过一系列信号转导作用，对精子功能起到调节作用；外部添加高浓度Ca²⁺可致使精子蛋白酪氨酸磷酸化降低，ATP含量减少^［12］ 。近年的许多研究表明，Ca²⁺在精子获能和顶体反应中起重要的作用^［13］。获能过程中精子细胞内Ca²⁺浓度升高^［14］，特别是在顶体区^［15］ ，超激活运动与鞭毛区Ca²⁺ 浓度升高有关。也有学者指出，获能过程中Ca²⁺浓度升高与精子细胞内储存的Ca²⁺释放有关，这个过程的调控需要Ca²⁺-ATP酶、IP 3受体、蛋白TPC、Ryanodine受体等的参与^［16］。精子胞质内Ca²⁺浓度的升高和蛋白质酪氨酸磷酸化，是顶体外膜中的Ca²⁺-ATP酶活性被抑制的结果^［17］。故检测冷冻精子中Ca²⁺浓度对精子获能状态具有参考意义。
试验试图通过运用G酶抑制剂作为一种阻断剂，揭示其对猪精子冻后获能状态的影响。

1  材料与方法

1.1  猪精液来源  

猪精液来源于体格健壮、性欲旺盛的长白公猪，由广西科达畜禽改良有限责任公司提供。

1.2  主要试剂

葡萄糖、果糖、氯化钠、柠檬酸、二水柠檬酸钠、PBS、多聚甲醛等均为国产优级纯，考马斯蓝R250购自北京索莱宝试剂公司，0.25 mL塑料细管购自法国卡苏公司，Ca²⁺检测试剂盒购自碧云天试剂公司。

1.3  主要仪器

精子程序化自动冷冻仪（法国卡苏公司），SD-2液晶显示器显微镜（圳泰宇星光电仪器有限公司），电子车载冰箱（北京福意联电器有限公司），液氮罐（成都金凤液氮容器有限公司），恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）。

2  方法

2.1  精液采集

采用手握法收集中段富含精子的精液，四层纱布过滤，37℃下用光学显微镜观察精液品质。选择状态、颜色正常，无特殊异味，精子活力≥0.7的优质精液，混合后加入精液稀释液并再次镜检^［18］，保留合格精液1 h内运回实验室，备用。

2.2  试验分组

试验分为4组：新鲜组、TCM获能组、试验组（根据G酶抑制剂浓度25、50、75、100 mg/L分别按照不同的时间30、60、90 min孵育，排列组合12个组）和空白对照组。

2.3  精子的获能处理

参照ZengHT^{［ 5］}改良的Tyrode's培养液为精子获能液（mT）。首先取新鲜的精液于50 mL离心管中离心（1200rpm，5min），弃上清，加等温的1×PBS洗两次，取500 μL的精液于1.5 mL的获能液中，在37℃、5% CO₂培养箱中孵育4 h。

2.4  精液的冷冻

2.4.1  精液的稀释与平衡

配置好冷冻基础液（TCG 表1）用以配备冷冻液，将镜检合格的精液分装到50 mL的离心管中，室温下离心（1200 rpm，5 min），弃上清，然后与稀释Ⅰ液（表2）等体积混合。分别按照不同的时间（30、60、90 min）孵育后加入等体积的冷冻稀释Ⅱ液（表3）（即精液：冷冻稀释Ⅰ液：稀释Ⅱ液=1∶1∶1）。用0.25 mL的塑料细管分装，2 h内缓慢降温到5℃，并在该温度下平衡2 h。平衡后检测活力合格后放入程序降温仪内，采用猪精液冷冻程序冷冻，投入液氮中保存。
表1  冷冻基础液（TCG）

葡萄糖（g）	柠檬酸（g）	Tris（g）	青链霉素（%）	ddH2O（mL）
5.5	7.4	12.1	5	500

 
表2  稀释Ⅰ液

TCG（%）	卵黄（%）
80	20

 
表3  稀释Ⅱ液

TCG（%）	甘油（%）
91	9

2.4.2  精液的解冻

从液氮中取出细管，迅速投入60℃水浴锅中5 s，擦干细管上的水，与常温等体积的BTS解冻液（表4）混合，于17℃环境保存。显微镜下观察精子活力。
表4  BTS解冻液

葡萄糖（g）

二水柠檬酸钠（g）

NaHCO3 （g）

EDTA （g）

KCl （g）

青链霉素（mL）

ddH2O（mL）

 

2.5  解冻后精液品质检测

2.5.1  精子活力的检测

精子解冻后取10μL于提前预热好的载玻片上，盖上盖玻片在37℃载物台上200~400倍显微镜下观察精子活力，以0~1.0的十级评分法评定精子活力，如有50%的精子作直线运动，活力计为0.5^［19］，每组选取5个视野，重复五次。 

2.5.2  精子顶体完整率的检测

精子解冻后取100 μL于1 mL 3.7%的多聚甲醛中固10 min，4℃离心（1000 rpm，8 min），弃上清。加1 mL PBS洗一次（（1000 rpm，8 min），弃上清，加100 μL PBS制成悬液。混匀后取10 μL制成涂片，自然晾干。把风干后的载玻片于装有考马斯亮蓝染色缸中，置于水浴锅中37℃下染色20 min后取出，自来水轻轻冲洗，置于染色架上自然风干。光学显微镜下（400×）观察顶体完整性（顶体完整的精子头部均匀的染成蓝色，表面光滑，轮廓清晰），随机选取5个视野，至少计数200个精子，重复五次。

2.5.3  质膜完整性的检测

精子解冻后取100 μL于果糖柠檬酸钠低渗溶液中，调整精子密度到（1~2）×10⁶ /mL，37℃条件下孵育30 min，取20 μL于载玻片上，盖上盖玻片，于光学显微镜（400×）下观察精子弯尾率，即质膜完整性，重复五次。

2.6  Ca²⁺浓度的检测  

分别取0.5mL新鲜组、空白对照组、试验组、获能组精液于1 mL的1×PBS中离心（1000 rpm，5 min），弃上清，重复上述步骤。根据Ca²⁺检测试剂盒说明检测细胞内Ca²⁺浓度，运用荧光分光光度计检测荧光值，重复三次。

2.7  统计分析

采用 Excel、Spss统计软件、Graphpad Prism作图软件，利用t检验和单因素方差分析对试验数据进行处理。

3  结果

3.1  G酶抑制剂对冷冻-解冻后猪精子质量的影响

 
 
表5-1  精子活力、顶体完整率及质膜完整性（30 min）
（*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异极显著（P<0.01）；无标记表示差异不显著）

	活力 Motility	顶体完整率 Normal acrosome rate	质膜完整性 Plasma membrane integrity
0mg/L	19.4±5.18	29.36±3.69	31.74±5.26
25mg/L	19.4.0±4.39	31.73±2.83	32.38±6.45
50mg/L	26.0±5.48*	32.93±3.47	37.4±7.55
75mg/L	23.6±1.95	32.06±2.27	35.62±4.31
100mg/L	19.4±9.05	30.16±4.6	29.21±3.9
新鲜组	69.18±1.57	88.56±3.62	55.63±1.59
获能组	35.4±2.07	40.88±4.00	25.64±3.55

 
表5-2  精子活力、顶体完整率及质膜完整性（60 min）
（*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异极显著（P<0.01）；无标记表示差异不显著）

	活力 Motility	顶体完整率 Normal acrosome rate	质膜完整性 Plasma membrane integrity
0mg/L	18.2±3.63	27.97±3.56	29.26±4.49
25mg/L	21.0±6.48	30.82±1.42	29.41±2.35
50mg/L	27.2±5.89**	42.18±11.3**	29.8±4.18
75mg/L	23.0±5.83	33.94±3.45	31.49±1.79
100mg/L	33.74±3.08**	31.63±3.03	32.68±0.45
新鲜组	69.18±1.57	88.56±3.62	55.63±1.59
获能组	35.4±2.07	40.88±4.00	25.64±3.55

 
表5-3  精子活力、顶体完整率及质膜完整性（90 min）
（*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异极显著（P<0.01）；无标记表示差异不显著）

	活力 Motility	顶体完整率 Normal acrosome rate	质膜完整性 Plasma membrane integrity
0mg/L	16.2±3.56	27.14±7.5	30.78±3.04
25mg/L	20.8±6.76	32.55±2.26	31.58±1.12
50mg/L	28.2±4.87*	36.14±4.89*	38.21±7.65*
75mg/L	29.0±9.19*	33.58±4.84*	29.76±6.56
100mg/L	24.0±6.52*	32.72±1.45*	31.38±5.25
新鲜组	69.18±1.57	88.56±3.62	55.63±1.59
获能组	35.4±2.07	40.88±4.00	25.64±3.55

 
精子活力检测结果提示，当冷冻稀释液中的G酶抑制剂为60 min（100 mg/L）时精子的活力******，与空白对照组相比差异极显著（P＜0.01），且精子活力优于其他各试验组，表明该浓度的G酶抑制剂能够改善冻后精子活力。
精子顶体完整性检测结果提示，当冷冻稀释液中G酶抑制剂为90 min（50、75、100 mg/L）时顶体完整率与空白对照组相比差异显著（P<0.05）；60 min（50 mg/L）组顶体完整率差异极显著（P<0.01），优于其他各试验组，表明该浓度的G酶抑制剂能够达到改善冷冻后精子顶体完整率的作用。
精子质膜完整性检测结果提示：当冷冻液中G酶抑制剂为为90 min（50 mg/L）时质膜完整性与空白对照组相比差异显著（P<0.05），其他组差异均不显著，表明G酶抑制剂能改善冷冻过程中精子质膜完整性的下降。

3.2  酪氨酸蛋白激酶抑制剂对冷冻-解冻后猪精子内Ca²⁺浓度变化的影响

Ca²⁺浓度检测结果提示，当冷冻液中G酶抑制剂为为 60 min（100 mg/L）和90 min（75 mg/L）试验组与获能组相比差异显著（P<0.05）；60 min（100 mg/L）条件下，Ca²⁺浓度降低与对照组相比差异显著（P<0.05），且优于90 min（75 mg/L）试验组，表明冷冻液中添加G酶抑制剂确能起到抑制精子低温环境下的被动获能，提高冻精品质。
 

4  讨论

蛋白质磷酸化参与调节细胞多种生命活动过程，包括细胞的增殖、发育和分化、细胞骨架调控、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢，肿瘤发生等^［20］。Tash和Means指出哺乳动物精子中存在各种磷酸化蛋白、蛋白激酶和蛋白质磷酸酶，提示蛋白质磷酸化、去磷酸化与精子生理过程有关^［14］。Ca²⁺作为机体中重要的第二信使，几乎参与了机体内细胞、精子的一切生理活动，Ca²⁺浓度的检测可作为验证冷冻精子的获能状态的参照。
酪氨酸蛋白磷酸化是精子获能过程中公认的重要因素之一，利用G酶抑制剂加入冷冻稀释液中阻断精子冷冻解冻过程的被动获能，其效果显著。经综合分析后确认当G酶抑制剂浓度为100 mg/L，孵育时间为60 min时，G酶抑制剂能达到******保护效果，可能抑制精子冷冻过程中被动获能，提高猪精液的冻后质量。
精子冷冻过程中可能发生一系列变化，如受冷冻时低温应激发生被动获能，这些事件受到涉及各种因子如：低温环境下精子内受体酪氨酸激酶和非受体酪氨酸激酶的细胞内信号通路激活的调节，通过激活第二信使分子cMAP等激活精子蛋白的磷酸化是获能的一个重要因素，与超激活、透明带结合和顶体反应相关^［4-6］。精子获能过程涉及到蛋白质磷酸化的各种途径，如cAMP / PKA 、受体酪氨酸激酶和非受体蛋白酪氨酸激酶3个主要途径。这些途径并不是相互排斥的，可能涉及几个分子之间的串扰。目前虽然弄清了一些影响精子获能过程中酪氨酸磷酸化的因素，但是确切的蛋白质磷酸化的路径尚未明确，如cAMP / PKA 途径如何上调酪氨酸磷酸化等^［11］，本研究仅探讨G酶抑制剂对冷冻过程中猪精子获能状态的影响，当G酶抑制剂浓度为100 mg/L，孵育时间为60 min时提示精子解冻后活力及状态较佳，但对于其具体的抑制通路及机制仍需要做进一步的研究。
参考文献：略