与仔猪生长性能和出生体重相关的粪便微生物群的变化

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来源：猪脑子学术

1前言

胃肠道微生物群与宿主相互作用，以调节代谢表型。这种相互作用可以让我们了解为什么一些低出生体重的猪会表现出补偿性生长，而其他的猪仍然发育不良。本研究旨在识别与高低初生重和平均日增重相关的微生物标记。此外，该研究还确定了这些分类标记是纵向的，且表现在特定时间点。

2材料方法

2.1试验设计

实验包括2×2阶乘设计，在10个不同时间点重复测量：实验因素为仔猪出生体重（LBW或NBW）和出生至56天ADG分类（“差”或“好”）。称重两批仔猪（出生后6-12h；第0天）为LBW（0.80-1.25kg）或NBW（1.50-2.00kg）。不属于LBW和NBW类别的仔猪被排除在研究之外。在某时间段内，计算开始的平均体重和最后的平均体重，再计算群体平均日增重，个体日增重高于群体平均日增重则定义为“好”ADG类，低于则为“差”ADG类。

本研究采用10头试验母猪的26头实验仔猪（大白猪）。实验仔猪组成了13对LBW和NBW仔猪。母猪在妊娠110天时上产床，分娩后将每窝标准化为12只仔猪，第28天断奶。实验期间，实验仔猪均未接受任何抗生素治疗。

在第4、8、14、21和27天时对猪进行称重，并从每只实验猪收集一份粪便样本。断奶后，猪再次称重，并在32、35、42、49和56天取样粪便。

2.2 16S rRNA测序

V4区域测序，qiime2分析。样本元数据被保存在NCBI序列读取存档(SRA)中，该存档位于生物项目ID：PRJNA603533。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/603533。

2.3统计分析

所有统计分析均在R3.4.4版进行。考虑的主要固定效应是猪年龄、BiW（初生重）类和ADG类，以处理其之间所有可能的双向和三方相互作用。仔猪ID嵌套在母猪ID内，并在所有模型中被指定为随机效应，因为这些变量在数据集中形成了重复的度量。使用“emmeans”包分析固定效应影响以及固定效应之间的相互作用的影响。使用Tukey HSD方法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2.4仔猪性能

使用“nlme”包运行混合线性模型测试仔猪不同初生重对所有试验时间点的活重和日增重的影响。根据似然比奇方统计量的输出和嵌套的随机效应对应的P值，对于没有影响的模型予以删除。

2.5仔猪肠道微生物

使用“vegan”包计算OTU数和香农多样性指数。为了确定菌群丰富度和多样性的纵向变化对固定效应的影响，使用“lme4”包中的泊松回归模型对观察到的OTU运行了GLMER。使用“nlme”包对香农指数的固定效应执行LME。使用“vegan”包中的Adonis功能进行PERMANOVA，进行999次蒙特卡洛排列，以确定基于固定效应的微生物群群落组成之间是否存在纵向差异。PERMANOVA使用了Bray–Curtis矩阵。

为了确定属丰度如何受到固定效应的影响，对前20个最丰富的属进行了纵向模拟。分类建模是在属水平进行的，在分类分配允许的情况下，通过“glmmTMB”包生成广义线性混合模型。

3结果

3.1实验仔猪队列性能和微生物组成概述

实验队列显示没有健康不良的症状，在研究期间没有接受抗生素。仔猪年龄和BiW对活重有显著影响(P<0.001)，LBW猪在所有时间点的活体重持续较低(图1A)

虽然年龄对ADG有显著影响，但与BiW没有显著的交互作用(图1B)。随着年龄的增长，ADG增加(P<0.05)，然而ADG的急剧下降与断奶及饮食变化有关，在实验的最后一周，仔猪从商业断奶饲料转换为家庭碾磨的断奶餐。对于LBW仔猪，出生至56天的平均日增重为0.28kg/d(SE=0.010)，而NBW仔猪是0.37kg/d(SE=0.016)。

测序得到了1700个OTU，对应于19个门、25纲、41目、67科和158属。在门层面（图1C），微生物群以厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为主，断奶前蛋白杆菌（Proteobacteria）的丰度较低。在整个哺乳期，蛋白杆菌（Proteobacteria）的平均丰度显著下降，从第8天的平均13.4%下降到第27天的4.97%。断奶后，每个取样时间点的平均蛋白杆菌丰度低于1%。厚壁菌门从第4天（平均49.46%）至第56天（平均81.29%）丰度稳步增加，成为最主要的门。随着仔猪年龄的增加，拟杆菌门的丰度变异性较小，丰度在第4和56天的水平之间波动（平均分别为35.49和13.82%）。

在仔猪管理和发育中，几个菌群的平均相对丰度发生了变化，如新生儿阶段、断奶和蠕变饲料的引入（补充表S1）。

在属层面上，乳酸杆菌（Lactobacillus）是整个研究中最主要的属。然而，其丰度从21日龄时的26.71%急剧下降到27日龄时的4.47%。断奶后，乳酸杆菌的丰度在56日龄时稳步增加到24.68%。多形杆菌（Bacteroides）是第二丰富的属，4日龄仔猪丰度最高（28.82%），之后稳步下降，到56日龄时丰度为0.02%。志贺氏杆菌（Escherichia-Shigella）在新生仔猪中丰度较高（4日龄为10.20%)，但随着日龄增加而减少(27日龄为2.25%)，断奶后丰度进一步下降(平均0.4%）。

几个最初较低的丰度属在8~14天的平均丰度增加，与蠕变饲料的引入相吻合。这些属包括：Christensenellaceae R-7 group（0.77%增加到4.49%）、Ruminococcaceae UCG-005（0.55%增加到2.38%）、Rikenellaceae RC9 gut group（0.75%增加到1.68%）、Prevotella 2（0.81%增加到6.33%）和Ruminococcaceae NK4A213 group（0.75%增至1.39%）。断奶后（27-32日龄）的平均丰度增加的属有：Prevotella 9（1.01%增加到7.65%）、Ruminococcaceae UCG-014（1.72%增加到2.97%)、Subdoligranulum(2.05%增加到3.19%)和Faecalibacterium(0.22%增加到2.65%）。

3.2微生物群组成与出生体重等级的关系

在观察到的OTUs数量上，仔猪年龄与BiW之间存在显著的相互作用。在21日龄NBW仔猪观察到的OTUs数量显著增加，而在27、32和56日龄LBW猪观察到的OTUs数量显著增加(图2A；P<0.05)。

Bray-Curtis距离矩阵显示BiW对微生物群的总体组成没有显著影响。对前20个最丰富的属进行建模，发现BiW对Ruminococcaceae UCG-005(P<0.01)和Ruminococcaceae UCG-014(P<0.01)的丰度有显著影响，LBW猪在21日龄时丰度较低(LBW1.16%，SE=0.005对NBW3.95%，SE=0.011)，32日龄时丰度较高(LBW5.01%，SE=0.012对NBW1.33%，SE=0.004)(图2B，C)。

3.3微生物组成与平均日增重等级的关系

对观察到的OTUs和Shannon指数的数量和Bray-Curtis距离矩阵的结果没有显著影响。然而，对最丰富的20个属的分析结果表明，经过配对调整后，仔猪年龄与ADG之间存在显著的关联。分配给“好”ADG类的小猪在4日龄时有明显较高的乳酸杆菌（Lactobacillus）丰度(“好”35.93%，SE=0.065对“差”16.92%，SE=0.041，P<0.05)，8日龄时未分类的普雷沃氏菌（Prevotellaceae）(“好”4.68%，SE=0.018对“差”2.57%，SE=0.024，P<0.05)，14日龄时(“好”4.25%，SE=0.011对“差”0.50%，SE=0.001，P＜0.01)(图3A-C)。

3.4微生物组成、BiW和ADG类别之间的交互关联

仔猪年龄、BiW和ADG对观察到的OTUs数有三方相互作用(补充表S2)。在21日龄，“差”和“好”ADG的NBW仔猪观察OTUs数量高于“差”和“好”LBW仔猪(P<0.05)，而在第27天，“差”和“好”LBW猪的观察OTUs数量高于“好”ADG级的NBW猪(P<0.05)。在32日龄，“差”和“好”LBW猪与“差”和“好”NBW猪相比，观察到的OTUs数量更多(P<0.05)。

补充表S2

Days of age * BiW class * ADG class	Number of observed OTUs	Ruminococcaceae UCG-005 relative abundance	Replicates (n =)
4 LBW Good	51^a	1.00E-06^a	6
4 LBW Poor	60^abcd	0.0009^abcde	5
4 NBW Good	59^abc	1.00E-06^ab	4
4 NBW Poor	54^ab	0.0001^ac	4
8 LBW Good	65^abcd	0.0045^abcdef	4
8 LBW Poor	67^bcde	0.0003^abcd	6
8 NBW Good	77^abcdefg	0.0135^bcdefghi	5
8 NBW Poor	70^abcdef	0.0117^bcdefghi	7
14 LBW Good	107^fghijknpq	0.0270^fghi	5
14 LBW Poor	70^bcdefgh	0.0060^abcdefghi	2
14 NBW Good	99^efghijk	0.0683ⁱ	3
14 NBW Poor	98^ghijklm	0.0047^abcdef	6
21 LBW Good	98^fghijk	0.0136^abcdefgh	5
21 LBW Poor	96^fghijklmno	0.0190^abcdefgh	5
21 NBW Good	163^uv	0.0450^hi	4
21 NBW Poor	127^pqrstu	0.0358^fghi	6
27 LBW Good	201^w	0.0294^ghi	5
27 LBW Poor	226^w	0.0260^fghi	2
27 NBW Good	139^{ijklmnopqrstuv}	0.0250^cdefghi	1
27 NBW Poor	169^vw	0.0246^ghi	5
32 LBW Good	136^orstu	0.0240^fghi	4
32 LBW Poor	132^qstu	0.0210^fghi	4
32 NBW Good	101^efghi	0.0080^abcdefgh	4
32 NBW Poor	96^fghikl	0.0070^abcdef	6
35 LBW Good	83^defghi	0.0053^abcdefg	3
35 LBW Poor	105^hijklmnopqrs	0.0183^fghi	4
35 NBW Good	91^cdefgh	0.0240^bcdefghi	2
35 NBW Poor	99^{ghijklmnopqrs}	0.0213^bcdefghi	3
42 LBW Good	90^efghi	0.0075^abcdefgh	6
42 LBW Poor	102^ghijklmnopr	0.0142^fghi	5
42 NBW Good	107^hijklmnopqrs	0.0083^bcdefghi	4
42 NBW Poor	99^fghijklm	0.0050^abcdefgh	4
49 LBW Good	132^lmorstu	0.0088^abcdefgh	5
49 LBW Poor	103^hijklmnopqrs	0.0090^bcdefghi	4
49 LBW Good	116^{hijklmnopqrst}	0.0070^bcdefghi	3
49 LBW Poor	128^nopqrstu	0.0096^efghi	5
56 LBW Good	140^stuv	0.0106^defghi	5
56 LBW Poor	142^tuv	0.0130^fghi	7
56 NBW Good	122^jklmnopqrst	0.0118^fghi	6
56 NBW Poor	120^kmnopqrstu	0.0081^bdefgh	7

对Bray-Curtis距离矩阵的PER MANOVA分析结果，BiW和ADG对微生物群的整体群落组成没有交互影响。然而，仔猪年龄、BiW和ADG三者之间存在显著的相互作用，在14日龄时，与NBW“差”ADG仔猪相比，NBW“好”ADG仔猪具有较高丰度的Ruminococcaceae UCG-005(5.03%，SE=0.032对1.37%，SE=0.008，P<0.001，补充表S2)。

3.5微生物组组成与仔猪年龄的关系

仔猪年龄对观察到的OTUs和香农多样性指数均有显著影响(P<0.05)(图4A，B)。OTUs数量和α多样性指数均增加到断奶时急剧下降，然后再增加至相对稳定。小猪年龄是肠道菌群组成发展的重要关键因素(P<0.001)

微生物区系从第4天至第8天的高度变化的群落组成发展到第35天的更均匀、稳定的微生物群

本研究是首次比较仔猪的出生体重及其与生长性能与早期微生物群的纵向特征之间的相互作用。主要研究结果证实固体饲料摄入时间调节显著的年龄相关微生物群变化，识别了与ADG和BiW相关的时间点特异性微生物标记。

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